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水通道蛋白1和細胞角蛋白7在卵巢腫瘤中表達的研究

【】2016-07-07 點擊次數
鄭曉霞 陳佩珊 張燕梅:汕頭大學醫學院第二附屬醫院 廣東汕頭 515041

水通道蛋白1和細胞角蛋白7在卵巢腫瘤中表達的
研究

鄭曉霞 陳佩珊 張燕梅
EXPRESSION OF AQUAPORIN 1 AND CYTOKERATIN 7 IN OVARIAN TUMORS
ZHENG Xiaoxia, CHEN Peishan, ZHANG Yanmei


  【摘 要】 目的 通過探究在卵巢腫瘤中細胞角蛋白7(CK7)及水通道蛋白1(AQP1)兩者的表達狀況,分析AQP1和CK7的相對應的關系以及探究兩種相應的蛋白對發生與發展在卵巢腫瘤中的一系列作用。對在早期診斷以及治療卵巢癌的新靶點以及防治后的評價給予了一定程度的依據。方法 取住院接受手術治療并確診為卵巢癌57例作為研究組;從卵巢交界性上皮性腫瘤患者、轉移性卵巢癌患者、卵巢良性上皮性腫瘤患者以及正常卵巢組織中分別選取12、8、15、10例作為對照組患者。檢查以上這些患者的腫瘤組織(如:卵巢癌、卵巢良性上皮性腫瘤組織、卵巢交界性上皮性腫瘤)中的AQP1、CK7的表達狀況和在正常卵巢組織中AQP1 、CK7的表達狀況。結果 在不同種類卵巢腫瘤組織中AQP1及CK7在表達上呈陽性機率之間的比較差異都具有統計學意義(P<005)。卵巢上皮性癌中APQ1 與CK7的表達成正比例關系。結論 CK7和AQP1都共同配合與參與了卵巢腫瘤的引發和發展這些過程。
  【關鍵詞】 卵巢腫瘤,水通道蛋白1,細胞角蛋白7
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.12.010 

  如今對于在初期診斷卵巢癌所采用的方式仍然沒有很大成效。因此大部分患者一旦察覺、發現有此病癥時就有很大可能是中期或是晚期卵巢癌。其中轉移性卵巢癌發病時癥狀很不明顯,危害性很大,在后期的防治方面效果也很差,一旦發現,五年之內死亡率也極其高,高達70%以上。所以一方面要降低此病癥給病患帶來生命威脅的機率也要在另一方面提高醫護人員對其的預后措施質量,相關學者應該研究有關卵巢癌在生物學上的基本特點,來深入分析此病癥的特點以及發病的原因,盡可能尋找出可以有效的在初期診斷出卵巢癌的方式。本研究通過患者的腫瘤組織(如:卵巢交界性上皮性腫瘤、卵巢癌、卵巢良性上皮性腫瘤組織)中的AQP1、CK7的表達狀況和在正常卵巢組織中AQP1 、CK7的表達狀況以及它們之間的相互關系,來探究在卵巢腫瘤發生之時AQP1與CK7對發病的作用。它可能為診斷患者是否是卵巢癌開創了一個更高的境地。它有效地指導了評估和改善預后這兩項工作。
     1 資料與方法
1.1 一般資料
     由2010年1月~2014年1月在汕頭大學醫學院第二附屬醫院婦科經手術處理并得到相應專家確實的漿液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、內膜樣癌、透明細胞癌分別有22例、18例、15例與2例,一共有57例患者被選擇為研究組。其中高、中、低分化(G1、G2、G3)分別有17例、22 例和18例患者。手術按照相關的病理區分期間階段(國際婦產聯盟FIGO,2000):有22例Ⅰ~Ⅱ期,有35例Ⅲ~Ⅳ期。依據手術后患者腹水的程度分為兩種狀況:腹水與無腹水分別有37例與20例。選取10例正常卵巢組織(其中有5例是從一側卵巢癌的對側正常卵巢的病例中選取,有5例是從子宮內膜癌切除的卵巢的病例中選取),將15例卵巢良性上皮性腫瘤患者、12例交界性腫瘤與8例轉移性卵巢癌選取為對照組患者。
1.2 方法
     采用二步驟免疫組化Envision的方法,探究方式步驟嚴格依據免疫組化檢測方法的步驟。選取探究材料:采用4%的體積分數的多聚甲醛液去固定,利用基本方式使其脫掉水分,用石蠟去包裹并埋入,連續做切片工作,切2張厚度為4~6 μm的切片。兩張切片依次進行不同染色應用,分別為免疫組織化學染色應用和蘇木素伊紅染色,兔抗人AQP1單克隆抗體試劑盒是在SANTA公司購買到的,CK7試劑都是在邁新公司購買到的。染色:將石蠟切片梯度酒精脫水后,采用3%過氧化氫孵育10 min之內,10 min微波修復抗原,再滴加非免疫血清,利用室內溫度孵育15 h,加入1∶ 200 兔抗人AQP1 和鼠抗人CK7多克隆抗體,在4℃溫度下過夜,采用蘇木素與DAB顯現顏色以及再次染色,然后封切片。用PBS代表3種一抗、用已知陽性組織切片分別作為對陰性與陽性的對照。
1.3 結果判讀
     CK7和AQP1陽性染色都呈現了棕黃色顆?;驈浡苑植?,位居于細胞膜或細胞漿。在高倍鏡(×100下對每張切片都任意選擇觀察5個視野。計數200個細胞/視野,共計1 000個細胞。通過統計陽性細胞個數的比率與染色程度來進行半定量評分。利用統計陽性細胞的個數來達到計分目的:0分表示無著色;1分表示1%~25%;2分表示26%~50%;3分表示51%~75%;4分表示大于75%。結合染色強度來進行評分即:0分即為不著色;1分即為黃色;2分即為棕色;3分即為棕褐色。評分結果:0~1分、2~3分、4~6分以及大于6分相對應結果分別為陰性(-)、弱陽性(+)、中等陽性(++)、強陽性(+++)。-~+為表達缺失、低表達;+++++為過表達;+~+++均為陽性。評分的結果是通過兩名有經驗的病理醫生所標準化的。
1.4 統計學分析
     利用統計軟件 SPSS 170來做相關的統計以及分析。應用“行與列表相乘”的2檢驗、2是確定是否檢驗正確的、Fisher采取四格表資料來確切概率法,利用Spearman相關去分析CK7與AQP1之間的相互關系,相關系數r表示相關性。當P<005時認定組間比較差異有統計學意義。
     2 結果
2.1 患者的腫瘤組織的AQP1的表達狀況和在正常卵巢組織中AQP1的表達狀況
     在免疫組化中抗體在細胞漿或細胞膜出現棕褐色或棕黃色顆粒是AQP1陽性表達的體現。AQP1在轉移性卵巢癌、原發性卵巢癌、良性上皮性腫瘤、交界性腫瘤和正常卵巢組織中的表達陽性率分別是789%(45/57)、750%(6/8)、667%(7/12)、267%(4/15)和200%(2/10)。這五組數據之間比較差異有統計學意義(2=23,P<005),見表1。

表1 AQP1在幾種不同組織中的表達情況

(n,%)

組織來源 例數
AQP1表達情況
++ +++
陽性率2P
正常卵巢 10 8 1 1 0 20.0 23 <0.05
良性腫瘤 15 11 2 2 0 26.7
交界性腫瘤 12 4 1 2 5 66.7
原發性卵巢癌 57 12 13 17 25 78.9
轉移性卵巢癌 8 2 1 2 3 75.0

2.2 患者的腫瘤組織的CK7的表達狀況和在正常卵巢組織中CK7的表達狀況
     CK 7在免疫組化中的陽性染色為表現在細胞漿或細胞膜上面的棕黃色或棕褐色顆粒,它在原發性卵巢癌、轉移性卵巢癌、良性上皮性腫瘤、交界性腫瘤和正常卵巢組織中的表達陽性率分別是929%、250%、583%、267%和100%。這五組數據比較差異有統計學意義(2=34,P<005),見表2。

表2 在幾種不同組織中CK7的表達狀況

(n,%)

組織來源 例數
CK7表達情況
++ +++
陽性率2P
正常卵巢 10 9 1 0 0 10.0 34 <0.05
良性腫瘤 15 11 4 0 0 26.7
交界性腫瘤 12 5 4 1 2 58.3
原發性卵巢癌 57 4 0 11 42 92.9
轉移性卵巢癌 8 6 1 1 0 25.0

2.3 卵巢癌組織中AQP1和CK7表達之間的相互關系
     由CK7在卵巢癌組織中表達為陽性和陰性的病例中可見,AQP1表達為陽性表達的機率分別是831%和250%,兩者比較,差異有統計學意義,其中r=0099,2=49,P<005,探究結果提示了卵巢癌組織中AQP1和 CK7成正比例關系,見表3。

表3 卵巢癌組織中AQP1和CK7表達之間的相互關系


類別 例數 AQP1(+) AQP1(-) r 2 P
CK7(+) 53 44 9 0.996 4.9 <005
CK7(-) 4 1 3

2.4 免疫組化檢測法檢測AQP1和CK7在各組織中的表達
     見圖1。

 

圖1 AQP1和CKT在各組織中的表達
3 討論
     最近十年之間,初期診斷并治療卵巢癌在醫療界一直是炙手可熱的研究話題。根據探究結果顯示,在卵巢癌新生的血管內部皮質細胞或是一些腫瘤癌巢中許多AQP1被表達。而在以上部位被表達的AQP1明顯比在卵巢交界性腫瘤中被表達得高很多。這提示了AQP1的高表達性和在表達的部位的腫瘤惡與良性有著密切的關聯。在相關的參考文獻中說明了AQP1可以引發癌癥,認為AQP1全長cDNA的異位表達可以導致很多。在表現方面的更改從而引發了惡性腫瘤[3]。
     FOLKMAN[4]提出了有關于腫瘤血管形成過程方面的假定,也就是在說明形成腫瘤新生的血管的時期明顯早于增生腫瘤細胞群的時期。他也提出了生長、浸潤以及轉移惡性腫瘤都完全依靠著形成與生長新生血管這一過程。許多基本的臨床探究也對以上這些說法表示贊同。在大量的腫瘤血管中AQP1被高表達,它是一種由腫瘤新生成的促進性的因子,也標記了血管增生這一過程,它配合生成血管這一過程。在國際相關的醫學報道中都認定AQP1可以增加新形成的腫瘤血管的數量,可以促進的侵襲與轉移腫瘤這些過程,在各種惡性腫瘤(如:宮頸癌、結直腸癌、肺癌等)都有一定的高表達[5-9]。并且在人體外部的相關探究實驗中表明,抑制AQP1的表達可以對侵襲與轉移腫瘤細胞這些過程起到一定逆轉的作用[10]。提示了AQP1是關系到腫瘤發生與進展的這些過程。
     利用鼠模型探究表明在腫瘤血管內部皮質中AQP1表達的減少與逆轉抑制、轉移原發腫瘤這些過程有著密切關系。抑制及轉移癌灶的減弱相互抑制,也深入提示了AQP1對生長腫瘤與浸潤轉移腫瘤有一定的作用[11-12]。另外還有一些探究表明在對一些惡性腫瘤(如:胸膜惡性間皮瘤、膽道腫瘤、腎癌等)的預后方面也與AQP1有著密切關聯[13-15]。
     細胞角蛋白是一種中間絲蛋白,它是構造細胞基本結構的重要部分?,F如今有20種亞型是被人了解的并且在各種臟器的上皮細胞內分布著。一般是在患者上皮細胞上分布,在組織與分化這兩個部分都有很好的的特異性。通過分析CK組型,對判定腫瘤細胞是否存在、分化的具體方位或是相關的病理組織的種類以及來源起到一定幫助的作用。CK的一個亞型是CK7(單克隆抗體),它是一種以分子量為54Kda存在著的堿性細胞角蛋白,它提取在人體內部的OTNⅡ卵巢癌株中,CK7在乳腺、肺、子宮內膜和間皮細胞都可以呈現以一種陽性方式表達。所以,進一步說明了CK7特別地標記了鑒定原發性上皮性腫瘤和轉移性腺癌這一過程,是其特異性標志物[16]。
     在卵巢上皮癌組織中CK7有著特別高的陽性表達機率,基本上可以達到90%以上,探究出的結果在本階段的實驗中也得到了一定的認可,另一方面本階段的實驗探究中的轉移性卵巢癌中的陽性表達機率很小只達到了25%得出的結果與原發性卵巢癌之間相比較其明顯的差異是具有統計學意義的,實驗探究也提示了CK7是具備嚴格的上皮組織特異性。
     發生發展和轉移腫瘤這一過程是由多個步驟、多個因子以及多種因素共同組成的非常復雜的過程,當細胞內外的各種信號對細胞產生刺激,此時細胞自身的殺傷程序會被激活,這一系列表現是細胞內主動進行自我破壞的過程,被稱作細胞凋亡,而當細胞凋亡與細胞增殖之間的平衡關系被打破時就會導致引發患者腫瘤的機率增高。多基因協同作用在對于探究惡性腫瘤之中一直是最受關注的課題。探究的課題也從前者漸漸過渡到惡性腫瘤的發生以及轉移,對于生成的腫瘤比如:在初期血管的增生、維持或是在末期時增生血管的延續。在不斷探究中使腫瘤血管通透性增加,新產生的腫瘤血管使腫瘤之間血管化,并且影響了腫瘤的生長以及擴散這些過程。通過進一步去探究信號轉導通路及血管生成基因調控,增加了相關人士研究抑制腫瘤血管增生以及腫瘤血管形成這些課題,對在臨床上治療腫瘤起到了很大的幫助作用。水通道蛋白可以有效地促使腫瘤血管的增生也使腫瘤血管的通透性增強。細胞角蛋白可以更好地體現出生

(下轉第41頁)(上接第37頁)
長與轉移腫瘤這些過程。兩者之間以及兩者與惡性腫瘤之間的相互關系已經被醫療界所重視,但是還需要深入去分析出它們之間的作用機理。
     如今許多國內外相關人士通過探究表明了在惡性腫瘤中常常會出現AQP1和CK7過度或者上調表達,通過觀察在卵巢癌中的表達陽性率發現它們之間有相同的地方,這是本研究得出的結果,在其他地方還沒有得出過相關的探究結果。它們在卵巢癌中的引發發展的影響及兩者之間相互關系反映出了在腫瘤發生及變化中的細胞凋亡、腫瘤血管生成這些復雜變化的關系。

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